Cefalotin được hấp thu kém ở đường tiêu hóa, nên phải tiêm. Sau khi tiêm bắp các liều 0,5g và 1g, trong vòng 30 phút sẽ đạt nồng độ đỉnh huyết tương tương ứng là 10 microgam và 20 microgam/ml. Tiêm tĩnh mạch liều 1g sẽ có nồng độ đỉnh huyết tương 30 microgam/ml sau 15 phút. Tiêm truyền liên tục 500mg/giờ sẽ có nồng độ đỉnh huyết tương từ 14 đến 20 microgam/ml. Truyền tĩnh mạch liều 2g trong 30 phút, nồng độ đỉnh huyết tương khoảng 90 microgam/ml trong vòng 30 phút sau khi tiêm truyền. Tiêm truyền có hiệu quả hơn tiêm bắp vì quan trọng là nồng độ đỉnh đạt được cao hơn nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn.
Cefalotin phân bố rộng khắp các mô và dịch của cơ thể, trừ não và dịch não tủy có nồng độ thấp và không thể dự đoán được. Thể tích phân bố của cefalotin là 18 lít/1,73m2 diện tích cơ thể. Cefalotin đạt nồng độ có thể đo được trong dịch màng phổi, nhãn phòng, mật, khớp và mô xương. Cefalotin qua hàng rào nhau thai vào tuần hoàn thai nhi và có nồng độ thấp trong sữa mẹ. Nửa đời trong huyết tương dao động từ 30 đến 50 phút, nhưng có thể kéo dài hơn ở người suy thận, nhất là đối với chất chuyển hóa. Khoảng 70% cefalotin trong tuần hoàn gắn kết với protein huyết tương.
Khoảng 20 – 30% cefalotin nhanh chóng bị khử acetyl trong gan và khoảng 60 – 70% liều dùng được bài tiết trong nước tiểu qua ống thận trong 6 giờ dưới dạng cefalotin và chất chuyển hóa desacetylcefalotin tương đối không hoạt tính. Sau khi tiêm bắp các liều 0,5 và 1g, cefalotin có nồng độ tương ứng cao trong nước tiểu là 0,8mg và 2,5mg/ml. Probenecid ngăn chặn sự bài tiết của cefalotin ở thận. Cefalotin bài tiết ở mật với số lượng rất ít.